针对婴儿佝偻病，医生会根据病史、小儿的症状和体征，结合辅助检查做出诊断。辅助检查通常包括血钙、血磷、碱性磷酸酶，以及血清25-羟基-D3。此外还有影像学的改变，如骨骼X线改变。血液生化检查主要为血清25-羟基-D3进行性降低，其它生化指标改变可分为三期：
1、第一期：血清钙降低，可伴有低钙症状，如手足搐搦、抽风等，多无明显的佝偻病体征，常见于6个月以下的婴儿，较大患儿较少见；
2、第二期：甲状旁腺激素代偿性升高，使1，25-二羟基-D3产生增加，导致血钙恢复正常，血磷降低，成骨细胞活跃，血清的碱性磷酸酶升高，如患儿蛋白质或锌缺乏严重，碱性磷酸酶可不升高，尿磷以及尿环一磷酰腺苷增多，氨基酸尿、尿钙减少，进而出现佝偻病的体征及骨骼改变；
3、第三期：血清甲状旁腺激素及碱性磷酸酶进一步升高，血磷降低。因为维生素D的储备耗竭而出现失代偿，最终血清的1，25-二羟基-D3及钙也降低，佝偻病的体征和骨骼改变更加重。
同时X线片也能显示出佝偻病的表现。佝偻病早期无症状及体征改变，骨X线片正常。当维生素D严重缺乏，骨骼改变后X片上才会有显示。婴儿早期以腕骨改变最为明显，是由于其早期耻骨桡骨远端干骺端生长板肥大，软骨细胞堆积，骺板边缘的骨皮向外膨隆突出所导致，是佝偻病唯一的早期诊断指征。急性期时，由于尺桡骨远端干骺端膨大，进而出现毛刷样征，骺线增宽、皮质变薄、松质骨骨小梁数量减少。